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Tipo do documento: Dissertação
Título: Caracterização da resposta imune funcional induzida por antígenos recombinantes baseados na estrutura da proteína tbpB de haemophilus parasuis
Título(s) alternativo(s): Characterization of the functional immune response induced by recombinant antigens based on the structure of the tbpB protein of haemophilus parasuis
Autor: Barasuol, Bibiana Martins 
Primeiro orientador: Frandoloso, Rafael
Resumo: Neste estudo, através de ensaios in vitro, apresentamos a caracterização funcional de anticorpos contra a proteína de união à transferrina B (TbpB) de Haemophilus parasuis. Quatro antígenos recombinantes baseados na estrutura da proteína TbpB foram desenvolvidos e avaliados neste estudo. As proteínas TbpB intacta (TbpB-I20-528aa), TbpB mutante [TbpB-M26-528aa (Frandoloso, et al. 2015)] e os subdomínios (lóbulos) N (TbpB-Nm20-282aa, versão mutante) e C (TbpB-C283-528aa) da TbpB de H. parasuis, sorovar 5, cepa Nagasaki, foram clonadas no vetor de expressão pET20 e expressadas em células de Escherichia coli cepa ER2566. A purificação dos antígenos foi realizada mediante cromatografia líquida de proteína. Suínos foram imunizados com os antígenos recombinantes potencializados com o adjuvante Montanide IMS 2215 VG PR e, a cinética da resposta de anticorpos foi analisada através de um ELISA indireto. A capacidade dos antissoros de reconhecerem 5 cepas virulentas de H. parasuis (Nº4 ¿ Sorovar (SV) 1; SW124 ¿ SV4; Nagasaki ¿ SV5; H425 ¿ SV12; 84-22113 ¿ SV14 e 84-15995 ¿ SV15) foi avaliada por citometria de fluxo, como também o efeito opsonizante dos anticorpos durante a fagocitose de H. parasuis realizada por neutrófilos suínos. Por último, analisou-se a capacidade dos diferentes antissoros de fixar a via clássica do sistema do complemento e, de produzir a morte das bactérias através de um ensaio bactericida mediado por anticorpos. Os resultados apresentados neste estudo demonstram que todos os antígenos recombinantes foram imunogênicos em suínos e, que os títulos de anticorpos mais elevados foram induzidos pelos antígenos TbpB-M e TbpB-C. Com exceção do SV4, todos os demais sorovares (SV1, SV5, SV12, SV14 e SV15) foram altamente reconhecidos (60 ¿ 90%) por um ou mais antissoros específicos, demonstrando que a proteína TbpB dos 5 sorovares virulentos analisados compartilham epítopos conservados tanto no lóbulo N e no lóbulo C da proteína TbpB. De maneira geral, o número de anticorpos associados às cepas avaliadas foi menor quando utilizou-se os antissoros produzidos com o antígeno TbpB-I. Interessantemente, observamos que a expressão homogênea da proteína TbpB nativa de H. parasuis (independente do sorovar) somente alcançada se o microrganismo for cultivado em condições restritivas de ferro. Com relação a fagocitose, observamos que o processo de opsonização, independente do tipo de anticorpo específico aumentou significativamente o número de neutrófilos com bactérias associadas, bem como o número de bactérias capturadas por cada neutrófilos. A porcentagem de neutrófilos com bactérias internalizadas foi significativamente maior quando os microrganismos estavam opsonizados, no entanto, este processo parece ser mais lento contra o SV12. Surpreendentemente, nenhum dos antissoros suínos foi capaz de ativar a via clássica do sistema do complemento (VCSC), sugerindo que o adjuvante Montanide IMS 2215 VG induza um isotipo de anticorpo com reduzida capacidade funcional em suínos. De maneira contrária, anticorpos produzidos em camundongos contra as proteínas TbpB-M TbpB-Nm e TbpB-C potencializadas com os adjuvantes de Freund e ou Montanide Gel 01 foram capazes de fixar VCSC contra todos os sorovares analisados. Em síntese, demonstramos neste estudo, a capacidade funcional dos anticorpos gerados contra 4 antígenos recombinantes baseados na estrutura da proteína TbpB de H. parasuis. Os resultados apresentados são úteis para predizer in vitro o potencial de proteção homólogo e heterólogo de vacinas baseadas nestes antígenos.
Abstract: In this study, through in vitro assays, we present the functional characterization the antibody against transferrin binding protein B (TbpB) from Haemophilus parasuis. Four recombinant antigen-based on the protein structure of TbpB were developed and evaluated in this study. The intact TbpB protein (TbpB-I20-528aa, mutant TbpB TbpB-M26-528aa and subdomains (lobes) NTbpB-Nm 20-282aa mutant version) and C TbpB-C283-528aa of TbpB from H. parasuis, serotype 5, Nagasaki strain, were cloned into pET20 expression vector and expressed in cells of Escherichia coli, strain ER 2566. The recombinant antigens were purified by liquid chromatography. Pigs were immunized with recombinant antigens adjuvanted with the adjuvant Montanide IMS 2215 VG PR and, the kinetics of antibody response was assessed by indirect ELISA. The antisera capacity to recognize 6 virulent strains of H. parasuis (Nº4 – Serovar (SV) 1, SW124 – SV4, Nagasaki – SV5, H425 – SV12, 84-22113 – SV14 e 84-15995 – SV15) was analyzed by flow cytometry, as well as the effect of antibodies opsonization during the H. parasuis phagocytosis performed by swine neutrophils. Finally, we analyze the ability of different antisera to activate the classical pathway of the complement system and to produce the killing of bacteria through antibody-mediated bactericidal assay. The results presented in this study demonstrate that all recombinant antigens were immunogenic in pigs and, that higher titres of antibodies were induced by antigens TbpB-M and TbpB-C, respectively. Except for SV4, all others serovars (SV1, SV5, SV12, SV14 e SV15) were strongly recognized (60-90%) by one or more specific antisera, demonstrating that TbpB protein from 6 virulent serovars analyzed share conserved epitopes in both lobes, N and C of the TbpB protein. In general, the number of antibodies associated with the strains was lower when we used the antisera produced with TbpB-I antigen. Interestingly, we observed that the homogenous expression of native TbpB protein from H. parasuis (independently of serovar) is only achieved if the microorganism is growth in iron starvation. Regarding the phagocytosis, we observed that the opsonization process, independently of the specific type of antibody, have increased the number of neutrophils with associated bacteria, as well, the number of bacteria captured by each neutrophil. The percentage of neutrophils with internalized bacteria was significantly higher when the microorganism was opsonized, however, this process seems to be slower against the SV12. Surprisingly, none of the swine antisera was capable of activating the classical pathway of the complement system (CPCS), suggesting that the Montanide IMS 2215 VG adjuvant has induced an antibody isotype with reduced functional activity in pigs. On the other hand, antibodies produced in mice against the TbpB-M, TbpB-Nm and TbpB-C protein adjuvanted with Freund adjuvant and/or Montanide Gel 01 were able to activate CPCS against all sevorars included. In summary, we demonstrate in this study, the functional activity of specific antibodies generated against four recombinant antigens based on the structure of TbpB protein from H. parasuis. The results presented are useful to predict in vitro the capacity of homologous and heterologous protection of vaccines based on these antigens.
Palavras-chave: Estudos soroepidemiológicos
Patologia veterinária
Suíno
Doenças
Área(s) do CNPq: CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA
Idioma: por
País: Brasil
Instituição: Universidade de Passo Fundo
Sigla da instituição: UPF
Departamento: Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária – FAMV
Programa: Programa de Pós-Graduação em Bioexperimentação
Citação: BARASUOL, Bibiana Martins. Caracterização da resposta imune funcional induzida por antígenos recombinantes baseados na estrutura da proteína tbpB de haemophilus parasuis. 2016. 68 f. Dissertação (Mestrado em Bioexperimentação) - Universidade de Passo Fundo, Passo Fundo, RS, 2016.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: http://tede.upf.br/jspui/handle/tede/1601
Data de defesa: 19-Aug-2016
Appears in Collections:Programa de Pós-Graduação em Bioexperimentação

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