@MASTERSTHESIS{ 2016:1839600237, title = {Caracterização da resposta imune funcional induzida por antígenos recombinantes baseados na estrutura da proteína tbpB de haemophilus parasuis}, year = {2016}, url = "http://tede.upf.br/jspui/handle/tede/1601", abstract = "Neste estudo, através de ensaios in vitro, apresentamos a caracterização funcional de anticorpos contra a proteína de união à transferrina B (TbpB) de Haemophilus parasuis. Quatro antígenos recombinantes baseados na estrutura da proteína TbpB foram desenvolvidos e avaliados neste estudo. As proteínas TbpB intacta (TbpB-I20-528aa), TbpB mutante [TbpB-M26-528aa (Frandoloso, et al. 2015)] e os subdomínios (lóbulos) N (TbpB-Nm20-282aa, versão mutante) e C (TbpB-C283-528aa) da TbpB de H. parasuis, sorovar 5, cepa Nagasaki, foram clonadas no vetor de expressão pET20 e expressadas em células de Escherichia coli cepa ER2566. A purificação dos antígenos foi realizada mediante cromatografia líquida de proteína. Suínos foram imunizados com os antígenos recombinantes potencializados com o adjuvante Montanide IMS 2215 VG PR e, a cinética da resposta de anticorpos foi analisada através de um ELISA indireto. A capacidade dos antissoros de reconhecerem 5 cepas virulentas de H. parasuis (Nº4 ¿ Sorovar (SV) 1; SW124 ¿ SV4; Nagasaki ¿ SV5; H425 ¿ SV12; 84-22113 ¿ SV14 e 84-15995 ¿ SV15) foi avaliada por citometria de fluxo, como também o efeito opsonizante dos anticorpos durante a fagocitose de H. parasuis realizada por neutrófilos suínos. Por último, analisou-se a capacidade dos diferentes antissoros de fixar a via clássica do sistema do complemento e, de produzir a morte das bactérias através de um ensaio bactericida mediado por anticorpos. Os resultados apresentados neste estudo demonstram que todos os antígenos recombinantes foram imunogênicos em suínos e, que os títulos de anticorpos mais elevados foram induzidos pelos antígenos TbpB-M e TbpB-C. Com exceção do SV4, todos os demais sorovares (SV1, SV5, SV12, SV14 e SV15) foram altamente reconhecidos (60 ¿ 90%) por um ou mais antissoros específicos, demonstrando que a proteína TbpB dos 5 sorovares virulentos analisados compartilham epítopos conservados tanto no lóbulo N e no lóbulo C da proteína TbpB. De maneira geral, o número de anticorpos associados às cepas avaliadas foi menor quando utilizou-se os antissoros produzidos com o antígeno TbpB-I. Interessantemente, observamos que a expressão homogênea da proteína TbpB nativa de H. parasuis (independente do sorovar) somente alcançada se o microrganismo for cultivado em condições restritivas de ferro. Com relação a fagocitose, observamos que o processo de opsonização, independente do tipo de anticorpo específico aumentou significativamente o número de neutrófilos com bactérias associadas, bem como o número de bactérias capturadas por cada neutrófilos. A porcentagem de neutrófilos com bactérias internalizadas foi significativamente maior quando os microrganismos estavam opsonizados, no entanto, este processo parece ser mais lento contra o SV12. Surpreendentemente, nenhum dos antissoros suínos foi capaz de ativar a via clássica do sistema do complemento (VCSC), sugerindo que o adjuvante Montanide IMS 2215 VG induza um isotipo de anticorpo com reduzida capacidade funcional em suínos. De maneira contrária, anticorpos produzidos em camundongos contra as proteínas TbpB-M TbpB-Nm e TbpB-C potencializadas com os adjuvantes de Freund e ou Montanide Gel 01 foram capazes de fixar VCSC contra todos os sorovares analisados. Em síntese, demonstramos neste estudo, a capacidade funcional dos anticorpos gerados contra 4 antígenos recombinantes baseados na estrutura da proteína TbpB de H. parasuis. Os resultados apresentados são úteis para predizer in vitro o potencial de proteção homólogo e heterólogo de vacinas baseadas nestes antígenos.", publisher = {Universidade de Passo Fundo}, scholl = {Programa de Pós-Graduação em Bioexperimentação}, note = {Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária – FAMV} }