@MASTERSTHESIS{ 2017:1087435230,
 	title = {Desenvolvimento de um ELISA in house indireto baseado na proteína p24 recombinante para diagnóstico da leucose enzoótica em bovinos},
 	year = {2017},
 	url = "http://tede.upf.br/jspui/handle/tede/1590",
 	abstract = "O vírus da leucemia bovina (BLV) é o agente etiológico da leucose enzoótica bovina (LEB), uma doença infecciosa persistente e altamente prevalente no gado leiteiro. Testes sorológicos e remoção de animais infectados são fundamentais para o controle da doença. No Brasil, a imunodifusão em gel de ágar (IDGA) usando o BLV produzido em cultivo de células de rim fetal de carneiro é o único teste comercial genuinamente brasileiro disponível para o diagnóstico da LEB. Para suprir essa deficiência no diagnóstico, desenvolvemos um ELISA indireto com base na proteína recombinante do capsídeo viral (p24) do BLV para detectar anticorpos em bovinos com diferentes aptidões. Para isso, foi desenhado um par de primer para amplificar por meio da PCR a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína p24, clonando o DNA resultante no plasmídeo pET-20. O plasmídeo foi clonado em Escherichia coli ER2566 cálcio-competente e a expressão da proteína foi induzida com IPTG (0.1mM). A proteína resultante (BLVp24r) foi purificada pelo sistema de cromatografia através da coluna HisTrap acoplada no equipamento ÄKTA Pure Chromatography e, posteriormente, analisada por SDS-PAGE. As características de antigenicidade e imunogenicidade da BLVp24r foram avaliadas através da técnica de Western Blot, utilizando soro policlonal de ratos imunizados com a BLVp24r e soro de bovinos naturalmente infectados, para posterior desenvolvimento do ELISA. Para o ELISA, o tipo de microplaca, a concentração de antígeno e a diluição de soro ideal foram determinados por titulação seriada das amostras. A análise da curva de Característica de Operação do Receptor (ROC) e a Análise de Área sob Curva (AUC) foram utilizadas para avaliar o desempenho do ELISA desenvolvido. Ao fim da padronização, realizamos um estudo soroepidemiológico da prevalência de anticorpos anti-BLV em soros de bovinos. A proteína BLVp24r foi expressa com a proteína de fusão com peso molecular de 67 KDa.. O soro de ratos imunizados e soro de bovinos naturalmente infectados com BLV reconheceram somente a proteína BLVp24r por Western Blot. A microplaca Polysorp® obteve melhor performance no ELISA com BLVp24r utilizando 50 ng/poço de proteína e soro bovino diluído a 1:100. O ELISA indireto padronizado para BLV possui um cut-off de 0.320 na OD450nm e apresentando uma sensibilidade de 98.5% e especificidade de 100%. A ROC representa um valor da ASC de 0,9989 (intervalo de confiança de 95% de 0,9961 em 1,002; p <0,0001), o que indica um alto nível de precisão. Com o ELISA padronizado, realizamos um estudo soroepidemiológico para validação do teste utilizando soros bovinos, demonstrando que a prevalência de anticorpos para o BLV foi de 31.1% em bovinos de leite e de 9.5% em bovinos de corte. O ELISA desenvolvido e otimizado utilizando a BLVp24r como antígeno é adequado para detectar anticorpos anti-BLV em soros bovinos e pode ser considerado um forte candidato a kit comercial visando o controle de BLV em bovinos.",
 	publisher = {Universidade de Passo Fundo},
 	scholl = {Programa de Pós-Graduação em Bioexperimentação},
 	note = {Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária – FAMV}
}